КОНСТРУЮВАННЯ ШТАМIВ – НАД ПРОДУЦЕНТIВ ФОРМАЛЬДЕГIДРЕДУКТАЗИ ТЕРМОТОЛЕРАНТНИХ МЕТИЛОТРОФНИХ ДРIЖДЖIВ HANSENULA РOLYMORPHA
DOI:
https://doi.org/10.18524/2307-4663.2013.3(23).48931Ключові слова:
формальдегідредуктаза, метилотрофні дріжджі Hansenula polymorpha, формальдегід, генно-інженерне конструюванняАнотація
Метою даної роботи було отримати рекомбінантні штами термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha надпродуцентів формальдегідредуктази (ФР), які можуть мати біоаналітичне використання. Методи. Дріжджі вирощували на синтетичному середовищі Беркгольдера (СБ) з наступним складом (у г /л): КН2РО4 – 1; (NH4)2SO4 – 3,5; MgSO4½7H2O – 0,5; CaCl2 – 0,1; зі стандартною кількістю мікроелементів та 0,05% (в/о) дріжджового екстракту. Джерелом вугл ецю слугували 1% гл юкоза (в/о) або 1% метанол (по об’єму). Загальні активності ферментів у безклітинних екстрактах визначали спектрофотометрично (Shimadzu-UV-1650) при 340 нм за швидкістю утворення NADH – для алкогольдегідрогенази (АДГ) чи утилізації NADH – для ФР, при кімнатній (20–25 °С) температурі. Питому активність (ПА) для кожного ферменту (в мкмоль·хв–1·мг–1 білка) розраховували за формулою: ПА = ПА+субстрат – ПА–субстрат, яка враховує неспецифічні фонові реакції. Результати. Сконструйовано плазміду експресії р21Sc21, що містить ген ADH1 Saccharomyces cerevisiae, під контролем сильного конститутивного промотора гена гл іцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAP1) H. рolymorpha. Дріжджові клітини H. polymorpha NCYC 495 (leu1-1) трансформували методом електропорації. Відбір інтегрантів проводили за резистентністю до зеоцину. Наявність у геномі трансформантів рекомбінатної плазміди, що містить ген ADH1 S. cerevisiae, перевіряли за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Висновки. Рекомбінантні штами характеризувались в 4–6 разів вищою активністю АДГ та в 2–3 рази вищою активністю ФР в безклітинних екстрактах порівняно з вихідним штамом. Стабільні трансформанти виявились резистентними до підвищених концентрацій формальдегіду (до 10 мМ) у ростовому метанольному середовищі.
Посилання
Демків О.М., Парижак С.Я., Красовська О.С., Стасик О.В., Гайда Г.З., Сибірний А.А., Гончар М.В. Конструювання штамів – надпродуцентів формальдегіддегідрогенази метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha // Біополімери і клітина. – 2005. – Т. 21, № 6. – С. 525–530. 2. Демкив О.М., Парижак С.Я., Ищук Е.П., Гайда Г.З. Гончар М .В. Активности ферментов катаболизма формальдегида у рекомбинантных штамм ов Hansenula polymorpha // Микробиология. – 2011. – Т. 80, № 3. – С. 301–307. 3. De Smidt O., du Preez J.C., Albertyn J. The alcohol dehydrogenases of Saccharomyces cerevisiae: a comprehensive review // FEMS Yeast Res. – 2008. – 8, № 7. – P. 967–978. 4. Faber K.N., Haima P., Harder W., Veenhuis M., Geert A.B. Highlyefficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha // Curr. Genet. – 1994. – 25. – P. 305–310. 5. Grey M., Schmidt M., Brendel M. Overexpression of ADH1 confers hyper-resistance to formaldehyde in Saccharomyces cerevisiae // Curr. Genet. – 1996. – 29. – P. 437–440. 6. Leskovac V., Trivic S., Pericin D. The three Zinc-containing alcohol dehydrogenases from baker’s yeast, Saccharomyces cerevisiae // FEMS Yeast Res. – 2002. – 2. – P. 481–494. 7. Lu K., Collins L.B., Ru H., Bermudez E., Swenberg J.A. Distribution of DNA adducts caused by inhaled formaldehyde is consistent with induction of nasal carcinoma but not leukemia // Toxicol. Sci. – 2010. – 116. – P. 441–451. 8. Paryzhak S., Shchoholeva M., Rebets Y., Gonchar M. Construction of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha strains overproducing formaldehyde reductase //12th International Congress on Yeasts (Kyiv, 11-15 August, 2008). – Kyiv, 2008. – P. 269. 9. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning, a laboratory manual. – 3rd ed. – Cold Spring Harbor Laboratory Press; New York, 2001. – 450 p. 10. Tang X., Bai Y., Duong A., Smith M.T., Li L., Zhang L. Formaldehyde in China: production, consumption, exposure levels, and health effects // Environment. International. – 2009. – 35, № 8. – P. 1210–1224. 11. Yurimoto H., Kato N., Sakai Y. Assimilation, dissimilation, and detoxification of formaldehyde, a central metabolic intermediate of methylotrophic metabolism // Chemical Record. – 2005. –5, № 6. – P. 367–37. 12. Yurimoto H., Oku M., Sakai Y. Yeast methylotrophy: metabolism, gene regulation and peroxisome homeostasis [Electronic resource] // Int. J. Microbiol. – 2011. – Online article available at: http://dx.doi.org/10.1155/2011/101298.
##submission.downloads##
Опубліковано
Номер
Розділ
Ліцензія
Авторське право (c) 2013 Мікробіологія і біотехнологія
Ця робота ліцензується відповідно до Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
Автор передає журналу (університету) на безоплатній основі невиключні права на використання статті (на весь строк дії авторського права починаючи з моменту публікації, розміщення статті на веб-сторінці журналу, в репозитарії відкритого доступу) без одержання прибутку; на відтворення статті чи її частин в електронній формі (включаючи цифрову); виготовлення ії електронних копій для постійного архівного зберігання; виготовлення електронних копій статті для некомерційного розповсюдження; внесення статті до бази даних репозитарію; надання електронних копій статті в доступі мережі інтернет.
Автор гарантує, що у статті не використовувалися статті або авторські права, які належать третім особам; гарантує, що на момент розміщення статті на веб-сторінці, в репозитарії ОНУ лише йому належать виключні майнові права на статтю, що розміщується; майнові права на статтю ні повністю, ні в частині нікому не передано (не відчуджено), майнові права на статтю ні повністю, ні в частині не є предметом застави, судового спору або претензій з боку третіх осіб.
Автор зберігає за собою право використовувати самостійно чи передавати права на використання статті третім особам.
Автор надає журналу право на використання статті такими способами:
переробляти, адаптувати або іншим чином змінювати її за погодженням з автором; перекладати статтю у випадку, коли стаття викладена мовою іншою, ніж мова, якою передбачена публікація у виданні. Якщо журнал виявить бажання використовувати статтю іншими способами: перекладати, розміщувати повністю або частково у мережі інтернет, публікувати статтю в інших, в тому числі іноземних виданнях, включати статтю як складову частину до інших збірників, антологій, енциклопедій тощо, умови оформлюються додатковою угодою.
Автор підтверджує, що він є автором (співавтором) цієї статті; авторські права на дану статтю не передані іншому видавцю; дана стаття не була раніше опублікована у будь-якому іншому виданні до публікації її журналом.
Публікація праць в Журналі здійснюється на некомерційній основі. Комісійна плата за оформлення статті не стягується.
