ЗАСТОСУВАННЯ ЗВОРОТНО-ТРАНСКРИПТАЗНОЇ ПОЛIМЕРА ЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦIЇ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ТА IДЕНТИФIКАЦIЇ ВIРУСУ IНФЕКЦIЙНОГО ПАНКРЕАТИЧНОГО НЕКРОЗУ РАЙДУЖНОЇ ФОРЕЛI (ONCORHYNCHUS MYKISS)
DOI:
https://doi.org/10.18524/2307-4663.2013.4(24).48975Ключові слова:
ЗТ-ПЛР, вірус інфекційного панкреатичного некрозу, райдужна форельАнотація
Мета роботи: розробити діагностичну тест систему для виявлення та ідентифікації інфекційного панкреатичного некрозу форелі на основі зворотно-транскриптазної полiмеразної ланцюгової реакцiї (ЗТ-ПЛР). Матеріали та методи Віруси: вірус інфекційного некрозу підшлункової залози штам референтний – Аb (8,0 lg ТЦД50 / см3); українські ізоляти – VF-11(6,8 lg ТЦД50 /см3), VF-08 (6,2 lg ТЦД50 /см3), вірус геморагічної симтецимії форелі (VHSV), штам «DH4p101» [AY546581] (8,0 lg ТЦД50 /см3). Перещеплювальні лінії клітин риб: FHM (хвостове стебло чорного толстоголова) і RTG (гонади райдужної форелі). Для виявлення та ідентифікації вірусу інфекційного панкреатичного некрозу форелі були використані дві пари олігонуклеотидних праймерів. Для пошуку та аналізу гомології генів білків VP2 і NS вірусу інфекційного панкреатичного некрозу використовували програму BLAST 2.0 Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) США. Конструювання і підбір праймерів проводили з використанням пакету програм «Vector NTI Advanced v.11» (Invitrogen, США). Результати досліджень. З метою підбору ефективних праймерів для постановки ПЛР нами було проведене порівняльне вивчення нуклеотидних послідовностей геному ізолятів IPNV різних генотипів. Для роботи були синтезовані олігонуклеотидні праймери, що фланкирують послідовності гена білка VP2. Розмір ампліфікованого фрагменту ДНК – 620 п.н. Додатково, в дослідженнях, були використані олігонуклеотидні праймери, специфічні до гену нуклеопротеїну (NS). Розмір ампліфікованого фрагменту ДНК – 204 п.н. При перевірці специфічності полімеразної ланцюгової реакції з підібраними праймерами як матриця були використані проби РНК референтних штамів та ізолятів IPNV виділених від малька райдужної форелі в господарствах України. Висновки. Розроблена діагностична тест-система на основі зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) є високоспецифічною та чутливою для виявлення та ідентифікації вірусу IPNV в матеріалах різного походження.
Посилання
Головина Н. А. , Бауер О. Н. . Ихтиопатология. – М.: Мир, 2007. – 448 с. 2. Вирусология. Методы: Пер. с анг / Под.ред. Б.Мейхи. – М: Мир, 1988. – 344 с. 3. Лысенко Е.А. Современные методы молекулярной биологии: Полимеразная цепная реакция. Стратегия подбора праймеров для анализа экспрессии генов. – М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. – C. 75– 96. 4. Ahne W., Negele R.D. Studies on the transmission of infectious pancreatic necrosis virus via eyed eggs and sexual products of salmonid fish. //In: Ellis, A.E. (Ed.), Fish and Shellfish Pathology. Academic Press. London. 1985. – Р. 262–270. 5. Antychowicz J. Choroby ryb srodladowych Antychowicz J. – Warszawa: Panstwowe Wydawnictwo Rolnicze i Lesne, – 2007. – 447 p. 6. Blake S.L., Schill W.B., McAllister P.E., Lee M.K., Singer J.T , Nicholson B. L. Detection and identification of aquatic birnaviruses by PCR assay. // J Clin Microbiol. – 1995. – V. 33(4). – P. 835–839. 7. Cutrin J.M., Barja J.L.; Nicholson B.L:, Bandin I., Blake S:; Dopazo C.P. Restriction fragment length polymorphisms and sequence analysis: an approach for genotyping Infectious pancreatic necrosis virus reference strains and other aquabirnaviruses isolated from northwestern Spain // Appl. Environm. Microbiol., – 2004. – № 70.V 2. – P. 1059–1067. 8. Dadar M., Peyghan R., Memari Hamid Rajabi. Sequence analysis of infectious pancreatic necrosis virus isolated from Iranian reared rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in 2012 // Virus Genes- September 2013. – Springer, Part of Springer Science+Business Media http: //link.springer.com /article /10.1007 /s11262-013-0981-4 9. Gravell, M., Malsberger R.G. A permanent cell line from the fathead minnow (Pirnephales prornelas). //Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1965. – V. 126. – P. 555–565. 10. Matvienko N, Buchatsky L, Deryabin O. Isolation of IPN virus from rainbow trout in the Ukraine // Diseases of Fish and Shelfish, (Split, September 12-16.2011):abstract book. – 2011. – Р. 363. 11. OIE. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals Fourth Edition, (Chapter 2.1.8.). – 2003. http: //www.oie.int /doc /ged /D6505.PDF 12. Reed L., Muench H. A simple method of estimating 50 % endpoints // Amer. J. Hygiene. – 1938. – V. 27. – P. 493–497. 13. Wolf K., Quimby. M. C.. Established eurythermic line of fish cells in vitro. Science (Washington DC) . – 1962. – V. 135. – P. 1065. 14. Wolf K ., Gravell M:, Malsberger R. G. Lymphocystis virus: Isolation and propagation in centrarchd fish cell lines. Science . – 1966. – V. 151. – P. 1004–1005
##submission.downloads##
Опубліковано
Номер
Розділ
Ліцензія
Авторське право (c) 2013 Мікробіологія і біотехнологія
Ця робота ліцензується відповідно до Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
Автор передає журналу (університету) на безоплатній основі невиключні права на використання статті (на весь строк дії авторського права починаючи з моменту публікації, розміщення статті на веб-сторінці журналу, в репозитарії відкритого доступу) без одержання прибутку; на відтворення статті чи її частин в електронній формі (включаючи цифрову); виготовлення ії електронних копій для постійного архівного зберігання; виготовлення електронних копій статті для некомерційного розповсюдження; внесення статті до бази даних репозитарію; надання електронних копій статті в доступі мережі інтернет.
Автор гарантує, що у статті не використовувалися статті або авторські права, які належать третім особам; гарантує, що на момент розміщення статті на веб-сторінці, в репозитарії ОНУ лише йому належать виключні майнові права на статтю, що розміщується; майнові права на статтю ні повністю, ні в частині нікому не передано (не відчуджено), майнові права на статтю ні повністю, ні в частині не є предметом застави, судового спору або претензій з боку третіх осіб.
Автор зберігає за собою право використовувати самостійно чи передавати права на використання статті третім особам.
Автор надає журналу право на використання статті такими способами:
переробляти, адаптувати або іншим чином змінювати її за погодженням з автором; перекладати статтю у випадку, коли стаття викладена мовою іншою, ніж мова, якою передбачена публікація у виданні. Якщо журнал виявить бажання використовувати статтю іншими способами: перекладати, розміщувати повністю або частково у мережі інтернет, публікувати статтю в інших, в тому числі іноземних виданнях, включати статтю як складову частину до інших збірників, антологій, енциклопедій тощо, умови оформлюються додатковою угодою.
Автор підтверджує, що він є автором (співавтором) цієї статті; авторські права на дану статтю не передані іншому видавцю; дана стаття не була раніше опублікована у будь-якому іншому виданні до публікації її журналом.
Публікація праць в Журналі здійснюється на некомерційній основі. Комісійна плата за оформлення статті не стягується.
