DOI: https://doi.org/10.18524/2307-4663.2013.4(24).48975

ЗАСТОСУВАННЯ ЗВОРОТНО-ТРАНСКРИПТАЗНОЇ ПОЛIМЕРА ЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦIЇ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ТА IДЕНТИФIКАЦIЇ ВIРУСУ IНФЕКЦIЙНОГО ПАНКРЕАТИЧНОГО НЕКРОЗУ РАЙДУЖНОЇ ФОРЕЛI (ONCORHYNCHUS MYKISS)

Н. М. Матвієнко, Л. П. Бучацький, О. М. Дерябін

Анотація


Мета роботи: розробити діагностичну тест систему для виявлення та ідентифікації інфекційного панкреатичного некрозу форелі на основі зворотно-транскриптазної полiмеразної ланцюгової реакцiї (ЗТ-ПЛР). Матеріали та методи Віруси: вірус інфекційного некрозу підшлункової залози штам референтний – Аb (8,0 lg ТЦД50 / см3); українські ізоляти – VF-11(6,8 lg ТЦД50 /см3), VF-08 (6,2 lg ТЦД50 /см3), вірус геморагічної симтецимії форелі (VHSV), штам «DH4p101» [AY546581] (8,0 lg ТЦД50 /см3). Перещеплювальні лінії клітин риб: FHM (хвостове стебло чорного толстоголова) і RTG (гонади райдужної форелі). Для виявлення та ідентифікації вірусу інфекційного панкреатичного некрозу форелі були використані дві пари олігонуклеотидних праймерів. Для пошуку та аналізу гомології генів білків VP2 і NS вірусу інфекційного панкреатичного некрозу використовували програму BLAST 2.0 Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) США. Конструювання і підбір праймерів проводили з використанням пакету програм «Vector NTI Advanced v.11» (Invitrogen, США). Результати досліджень. З метою підбору ефективних праймерів для постановки ПЛР нами було проведене порівняльне вивчення нуклеотидних послідовностей геному ізолятів IPNV різних генотипів. Для роботи були синтезовані олігонуклеотидні праймери, що фланкирують послідовності гена білка VP2. Розмір ампліфікованого фрагменту ДНК – 620 п.н. Додатково, в дослідженнях, були використані олігонуклеотидні праймери, специфічні до гену нуклеопротеїну (NS). Розмір ампліфікованого фрагменту ДНК – 204 п.н. При перевірці специфічності полімеразної ланцюгової реакції з підібраними праймерами як матриця були використані проби РНК референтних штамів та ізолятів IPNV виділених від малька райдужної форелі в господарствах України. Висновки. Розроблена діагностична тест-система на основі зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) є високоспецифічною та чутливою для виявлення та ідентифікації вірусу IPNV в матеріалах різного походження.


Ключові слова


ЗТ-ПЛР; вірус інфекційного панкреатичного некрозу; райдужна форель

Повний текст:

PDF

Посилання


Головина Н. А. , Бауер О. Н. . Ихтиопатология. – М.: Мир, 2007. – 448 с. 2. Вирусология. Методы: Пер. с анг / Под.ред. Б.Мейхи. – М: Мир, 1988. – 344 с. 3. Лысенко Е.А. Современные методы молекулярной биологии: Полимеразная цепная реакция. Стратегия подбора праймеров для анализа экспрессии генов. – М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. – C. 75– 96. 4. Ahne W., Negele R.D. Studies on the transmission of infectious pancreatic necrosis virus via eyed eggs and sexual products of salmonid fish. //In: Ellis, A.E. (Ed.), Fish and Shellfish Pathology. Academic Press. London. 1985. – Р. 262–270. 5. Antychowicz J. Choroby ryb srodladowych Antychowicz J. – Warszawa: Panstwowe Wydawnictwo Rolnicze i Lesne, – 2007. – 447 p. 6. Blake S.L., Schill W.B., McAllister P.E., Lee M.K., Singer J.T , Nicholson B. L. Detection and identification of aquatic birnaviruses by PCR assay. // J Clin Microbiol. – 1995. – V. 33(4). – P. 835–839. 7. Cutrin J.M., Barja J.L.; Nicholson B.L:, Bandin I., Blake S:; Dopazo C.P. Restriction fragment length polymorphisms and sequence analysis: an approach for genotyping Infectious pancreatic necrosis virus reference strains and other aquabirnaviruses isolated from northwestern Spain // Appl. Environm. Microbiol., – 2004. – № 70.V 2. – P. 1059–1067. 8. Dadar M., Peyghan R., Memari Hamid Rajabi. Sequence analysis of infectious pancreatic necrosis virus isolated from Iranian reared rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in 2012 // Virus Genes- September 2013. – Springer, Part of Springer Science+Business Media http: //link.springer.com /article /10.1007 /s11262-013-0981-4 9. Gravell, M., Malsberger R.G. A permanent cell line from the fathead minnow (Pirnephales prornelas). //Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1965. – V. 126. – P. 555–565. 10. Matvienko N, Buchatsky L, Deryabin O. Isolation of IPN virus from rainbow trout in the Ukraine // Diseases of Fish and Shelfish, (Split, September 12-16.2011):abstract book. – 2011. – Р. 363. 11. OIE. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals Fourth Edition, (Chapter 2.1.8.). – 2003. http: //www.oie.int /doc /ged /D6505.PDF 12. Reed L., Muench H. A simple method of estimating 50 % endpoints // Amer. J. Hygiene. – 1938. – V. 27. – P. 493–497. 13. Wolf K., Quimby. M. C.. Established eurythermic line of fish cells in vitro. Science (Washington DC) . – 1962. – V. 135. – P. 1065. 14. Wolf K ., Gravell M:, Malsberger R. G. Lymphocystis virus: Isolation and propagation in centrarchd fish cell lines. Science . – 1966. – V. 151. – P. 1004–1005


Пристатейна бібліографія ГОСТ






Creative Commons License
Ця робота ліцензована Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

ISSN 2076-0558 (Print); 2307-4663 (Online)

DOI 10.18524/2307-4663