ВИВЧЕННЯ КРІОУШКОДЖЕНЬ ВІЛЬНИХ ТА ІММОБІЛІЗОВАНИХ В ГЕЛІАЛЬГІНАТУ НАТРІЮ КЛІТИН ДРІЖДЖІВ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
DOI:
https://doi.org/10.18524/2307-4663.2015.4(32).57458Ключові слова:
дріжджи, кріоушкодження, іммобілізація, проточна цитофлуориметріяАнотація
Метою цього дослідження було виявлення особливостей ушкоджень клітин Saccharomyces сerevisiae, вільних та іммобілізованих в гелі альгінату натрію, в наслідок їх кріоконсервування. Методи. Об’єктом дослідження були клітини дріжджів S. сerevisiae. За допомогою флуоресцентних барвників AnnexinV і 7AAD методом поточної цитометрії проведено оцінку ушкоджень деконсервованих клітин S. сerevisiae. Результати. Притаманними ознаками негативного впливу низьких температур було порушення цілісності та ліпідної асиметрії цитоплазматичних мембран, фрагментація ДНК. Проведеним аналізом асиметричного розподілу фосфоліпідів у мембрані клітин дріжджів S.сerevisiae було показано, що перебудови у ліпідній організації мембрани можуть відбуватися не тільки під впливом фізико-хімічних факторів, але й під впливом кріопротекторів. Вихід фосфатиділсерину в зовнішній моношар ЦПМ спостерігали у 2,5% іммобілізованих клітин (2 група). Кількість AnnexinV-мічених клітин у групі 4 була в 2 рази більшою відносно кількості збережених клітин після заморожування. Подібну динаміку спостерігали і щодо такого роду ушкоджень у зразках вільних клітин. Проте, слід зазначити, що кількість AnnexinV-мічених клітин у групі 1 була значно меншою і відповідала рівню в контрольних зразках. Ми вважаємо, що зниження клітин з порушенням асиметричного розподілу фосфоліпідів у цій групі відбувалося за рахунок збільшення кількості повністю зруйнованих (що не зазнали аналізу) клітин у цих зразках. Встановлено, що в усіх досліджуваних зразках, включаючи контрольні, присутні клітини, які знаходяться на різних стадіях апоптозу. Різниця у зразках полягає в значенні відсотка клітин елімінованих з процесу аналізу поточної цитометрії. Кількість повністю зруйнованих клітин в іммобілізованих зразках була значимо меншою, ніж у групах вільних у суспензії клітин. Висновки. Встановлено, що під впливом ушкоджувальних чинників процесу кріоконсервування у частини вільних та іммобілізованих в гелі альгінату натрію клітин Saccharomyces cerevisiae розвиваються порушення цілісності й ліпідної асиметрії цитоплазматичних мембран, фрагментація ДНК. Показано, що наявність кріопротектора ДМСО в консервувальному середовищі призводить до збільшення числа кріоконсервованих клітин з асиметричним розподілом фосфоліпідів у клітинних мембранах. Кількість клітин, що знаходяться на ранній стадії апоптозу після заморожування під захистом ДМСО, в 2–2,5 рази перевищувала кількість подібних клітин, заморожених без кріопротектора. Кріоконсервування дріжджів у поліцукридному гелі альгінату натрію може бути альтернативним способом консервації біооб’єктів під захистом традиційних кріозахисних засобів, що дозволяє досягти високого ступеня життєздатності й збереженості клітин без використання кріопротекторів кріопротекторів.
Посилання
Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. – М.: МГУ, 1994. – 288 с.
Mahler S., Desille M., Fremond B. Hypothermic storage and cryopreservation of hepatocytes: the protective effect of alginate gel against cell damages // Cell Transplant. – 2003. – Vol. 12, № 6. – P. 579–592.
Siti-Ismail N., Bishop AE., Polak JM., Mantalaris A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance // Biomaterials. – 2008. – Vol. 29. – P. 3946–3952.
Dang S.M., Gerecht-Nir S., Chen J., Itskovitz-Eldor J., Zandstra P.W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture // Stem Cells. – 2004. – Vol. 22. – P. 275–282.
Li Z., Leung M., Hopper R., Ellenbogen R, Zhang M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds // Biomaterials. – 2010. – Vol. 31. – P. 404–412.
Грищенко В.И. Достижения и развитие криобиологии в Украине // Проблемы криобиологии. – 2005. – № 3. – С. 232–233.
Егорова Н.С. Практикум по микробиологии. – М: МГУ, 1976. – 307 с.
Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы. – К.: Наукова думка, 1978. – 204 с.
Пономарева В.Л., Высеканцев И.П., Гурина Т.М., Онасенко Е.С. Изучение влияния режимов охлаждения и защитных сред, содержащих альгинат натрия, на жизнеспособность клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Вісник проблем біології і медицини. – 2011. – Вип. 3, Т. 1 (87). – С. 35–37.
Скибо Ю.В., Абрамова З.И. Методы исследования программируемой клеточной гибели. Учебно-методическое пособие по курсу «Теория апоптоза». – Казань: ФГАОУ ВПО КФУ, 2011.– 61 с.
Engeland M. Van, Nieland L.J., Ramaekers F.C. Annexin-V-affinity assay: a review based on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure // J. Cytometry. – 1998. – Vol. 31. – P. 1–9.
Willingham Mark C. Cytochemical methods for the detection of apoptosis // J. of Histochemistry and Cytochemistry. – 1999. – Vol. 47, № 9. – Р. 1101–1109.
Гланц С. Медико-биологическая статистика / Под ред. Н. Е. Бузикашвили и Д. В. Самойлова. – М.: Практика, 1999. – 460 с.
Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V // J. Immunol. Meth. – 1995. – Vol. 184. – P. 39–51.
Пономарева. В.Л., Высеканцев И.П., Гурина Т.М., Онасенко Е.С., Пишко О.М. Изучение влияния условий криоконсервирования на жизнеспособность клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, иммобилизованных в альгинатном геле // Вісник проблем біології і медицини. – 2012. – Вип. 2, Т. 1 (92). – С. 14–17.
Algaier J., Himes R.H. The effect of DMCO on the kinetics of tubulin assembly // Biochim. Biophys. Acta. – 1988. – Vol. 954, № 3. – P. 235–243.
Yamamoto N. Effects of dimethyl sulfoxide on cytosolic ionized calcium concentration and cytoskeletal organization of hepatocytes in a primary culture // J. Cell Struct. and Funct. – 1989. – Vol. 14, № 14. – P. 75–85.
Билич Г.Л., Крыжановский В.А. Биология. Полный курс: В 4 т. – издание 5-е, дополненное и переработанное. – М.: Издательство Оникс, 2009. – Т. 1. – 864 с.
##submission.downloads##
Опубліковано
Номер
Розділ
Ліцензія
Авторське право (c) 2015 Мікробіологія і біотехнологія
Ця робота ліцензується відповідно до Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
Автор передає журналу (університету) на безоплатній основі невиключні права на використання статті (на весь строк дії авторського права починаючи з моменту публікації, розміщення статті на веб-сторінці журналу, в репозитарії відкритого доступу) без одержання прибутку; на відтворення статті чи її частин в електронній формі (включаючи цифрову); виготовлення ії електронних копій для постійного архівного зберігання; виготовлення електронних копій статті для некомерційного розповсюдження; внесення статті до бази даних репозитарію; надання електронних копій статті в доступі мережі інтернет.
Автор гарантує, що у статті не використовувалися статті або авторські права, які належать третім особам; гарантує, що на момент розміщення статті на веб-сторінці, в репозитарії ОНУ лише йому належать виключні майнові права на статтю, що розміщується; майнові права на статтю ні повністю, ні в частині нікому не передано (не відчуджено), майнові права на статтю ні повністю, ні в частині не є предметом застави, судового спору або претензій з боку третіх осіб.
Автор зберігає за собою право використовувати самостійно чи передавати права на використання статті третім особам.
Автор надає журналу право на використання статті такими способами:
переробляти, адаптувати або іншим чином змінювати її за погодженням з автором; перекладати статтю у випадку, коли стаття викладена мовою іншою, ніж мова, якою передбачена публікація у виданні. Якщо журнал виявить бажання використовувати статтю іншими способами: перекладати, розміщувати повністю або частково у мережі інтернет, публікувати статтю в інших, в тому числі іноземних виданнях, включати статтю як складову частину до інших збірників, антологій, енциклопедій тощо, умови оформлюються додатковою угодою.
Автор підтверджує, що він є автором (співавтором) цієї статті; авторські права на дану статтю не передані іншому видавцю; дана стаття не була раніше опублікована у будь-якому іншому виданні до публікації її журналом.
Публікація праць в Журналі здійснюється на некомерційній основі. Комісійна плата за оформлення статті не стягується.
