ВИВЧЕННЯ КРІОУШКОДЖЕНЬ ВІЛЬНИХ ТА ІММОБІЛІЗОВАНИХ В ГЕЛІАЛЬГІНАТУ НАТРІЮ КЛІТИН ДРІЖДЖІВ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

В. Л. Пономарьова, І. П. Висеканцев, О. С. Онасенко, П. М. Зубов

Анотація


Метою цього дослідження було виявлення особливостей ушкоджень клітин Saccharomyces сerevisiae, вільних та іммобілізованих в гелі альгінату натрію, в наслідок їх кріоконсервування. Методи. Об’єктом дослідження були клітини дріжджів S. сerevisiae. За допомогою флуоресцентних барвників AnnexinV і 7AAD методом поточної цитометрії проведено оцінку ушкоджень деконсервованих клітин S. сerevisiae. Результати. Притаманними ознаками негативного впливу низьких температур було порушення цілісності та ліпідної асиметрії цитоплазматичних мембран, фрагментація ДНК. Проведеним аналізом асиметричного розподілу фосфоліпідів у мембрані клітин дріжджів S.сerevisiae було показано, що перебудови у ліпідній організації мембрани можуть відбуватися не тільки під впливом фізико-хімічних факторів, але й під впливом кріопротекторів. Вихід фосфатиділсерину в зовнішній моношар ЦПМ спостерігали у 2,5% іммобілізованих клітин (2 група). Кількість AnnexinV-мічених клітин у групі 4 була в 2 рази більшою відносно кількості збережених клітин після заморожування. Подібну динаміку спостерігали і щодо такого роду ушкоджень у зразках вільних клітин. Проте, слід зазначити, що кількість AnnexinV-мічених клітин у групі 1 була значно меншою і відповідала рівню в контрольних зразках. Ми вважаємо, що зниження клітин з порушенням асиметричного розподілу фосфоліпідів у цій групі відбувалося за рахунок збільшення кількості повністю зруйнованих (що не зазнали аналізу) клітин у цих зразках. Встановлено, що в усіх досліджуваних зразках, включаючи контрольні, присутні клітини, які знаходяться на різних стадіях апоптозу. Різниця у зразках полягає в значенні відсотка клітин елімінованих з процесу аналізу поточної цитометрії. Кількість повністю зруйнованих клітин в іммобілізованих зразках була значимо меншою, ніж у групах вільних у суспензії клітин. Висновки. Встановлено, що під впливом ушкоджувальних чинників процесу кріоконсервування у частини вільних та іммобілізованих в гелі альгінату натрію клітин Saccharomyces cerevisiae розвиваються порушення цілісності й ліпідної асиметрії цитоплазматичних мембран, фрагментація ДНК. Показано, що наявність кріопротектора ДМСО в консервувальному середовищі призводить до збільшення числа кріоконсервованих клітин з асиметричним розподілом фосфоліпідів у клітинних мембранах. Кількість клітин, що знаходяться на ранній стадії апоптозу після заморожування під захистом ДМСО, в 2–2,5 рази перевищувала кількість подібних клітин, заморожених без кріопротектора. Кріоконсервування дріжджів у поліцукридному гелі альгінату натрію може бути альтернативним способом консервації біооб’єктів під захистом традиційних кріозахисних засобів, що дозволяє досягти високого ступеня життєздатності й збереженості клітин без використання кріопротекторів кріопротекторів.


Ключові слова


дріжджи; кріоушкодження; іммобілізація; проточна цитофлуориметрія

Повний текст:

PDF (Русский)

Посилання


Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. – М.: МГУ, 1994. – 288 с.

Mahler S., Desille M., Fremond B. Hypothermic storage and cryopreservation of hepatocytes: the protective effect of alginate gel against cell damages // Cell Transplant. – 2003. – Vol. 12, № 6. – P. 579–592.

Siti-Ismail N., Bishop AE., Polak JM., Mantalaris A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance // Biomaterials. – 2008. – Vol. 29. – P. 3946–3952.

Dang S.M., Gerecht-Nir S., Chen J., Itskovitz-Eldor J., Zandstra P.W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture // Stem Cells. – 2004. – Vol. 22. – P. 275–282.

Li Z., Leung M., Hopper R., Ellenbogen R, Zhang M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds // Biomaterials. – 2010. – Vol. 31. – P. 404–412.

Грищенко В.И. Достижения и развитие криобиологии в Украине // Проблемы криобиологии. – 2005. – № 3. – С. 232–233.

Егорова Н.С. Практикум по микробиологии. – М: МГУ, 1976. – 307 с.

Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы. – К.: Наукова думка, 1978. – 204 с.

Пономарева В.Л., Высеканцев И.П., Гурина Т.М., Онасенко Е.С. Изучение влияния режимов охлаждения и защитных сред, содержащих альгинат натрия, на жизнеспособность клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Вісник проблем біології і медицини. – 2011. – Вип. 3, Т. 1 (87). – С. 35–37.

Скибо Ю.В., Абрамова З.И. Методы исследования программируемой клеточной гибели. Учебно-методическое пособие по курсу «Теория апоптоза». – Казань: ФГАОУ ВПО КФУ, 2011.– 61 с.

Engeland M. Van, Nieland L.J., Ramaekers F.C. Annexin-V-affinity assay: a review based on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure // J. Cytometry. – 1998. – Vol. 31. – P. 1–9.

Willingham Mark C. Cytochemical methods for the detection of apoptosis // J. of Histochemistry and Cytochemistry. – 1999. – Vol. 47, № 9. – Р. 1101–1109.

Гланц С. Медико-биологическая статистика / Под ред. Н. Е. Бузикашвили и Д. В. Самойлова. – М.: Практика, 1999. – 460 с.

Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V // J. Immunol. Meth. – 1995. – Vol. 184. – P. 39–51.

Пономарева. В.Л., Высеканцев И.П., Гурина Т.М., Онасенко Е.С., Пишко О.М. Изучение влияния условий криоконсервирования на жизнеспособность клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, иммобилизованных в альгинатном геле // Вісник проблем біології і медицини. – 2012. – Вип. 2, Т. 1 (92). – С. 14–17.

Algaier J., Himes R.H. The effect of DMCO on the kinetics of tubulin assembly // Biochim. Biophys. Acta. – 1988. – Vol. 954, № 3. – P. 235–243.

Yamamoto N. Effects of dimethyl sulfoxide on cytosolic ionized calcium concentration and cytoskeletal organization of hepatocytes in a primary culture // J. Cell Struct. and Funct. – 1989. – Vol. 14, № 14. – P. 75–85.

Билич Г.Л., Крыжановский В.А. Биология. Полный курс: В 4 т. – издание 5-е, дополненное и переработанное. – М.: Издательство Оникс, 2009. – Т. 1. – 864 с.


Пристатейна бібліографія ГОСТ






DOI: https://doi.org/10.18524/2307-4663.2015.4(32).57458

Посилання

  • Поки немає зовнішніх посилань.


Creative Commons License
Ця робота ліцензована Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

ISSN 2076-0558 (Print); 2307-4663 (Online)